Processando dados brutos de scRNA-seq
Este notebook apresenta operações essenciais de linha de comando no Linux, abordando comandos fundamentais que são amplamente aplicáveis em diferentes linguagens de programação com mínimas adaptações. Essas habilidades básicas oferecem suporte à gestão eficiente de dados e à análise em biologia computacional. Além disso, exploraremos as etapas principais no processamento de leituras de sequenciamento bruto em matrizes de contagem utilizando o Cell Ranger, discutindo suas principais saídas e o papel na transcriptômica de célula única. O processamento de dados de scRNA-seq é uma etapa crucial na análise de célula única. O método escolhido para preparação da biblioteca determina se as sequências de RNA são capturadas a partir das extremidades dos transcritos (por exemplo, 10X Genomics, Drop-seq) ou de transcritos completos (por exemplo, Smart-seq), influenciando diretamente as análises subsequentes e os insights biológicos.
Instalar utilitários
SRAtoolkit
NOTA: Comandos Shell
Google Colab/Jupyter Notebook usando phyton como linguagem de programação padrão.
É permitido usar outras linguagens, como shell script.
Este é um marcador para o Google Colab entender que este é o código do Shell. Para seu uso pessoal, "!" não é necessário.
%%bash
# Uma hashtag é um comentário, esta parte do código não é usada. No entanto, serve para anotações importantes.
# É uma prática boa e comum em código como um lembrete e como um mecanismo para reprodução.
# Recomendamos sempre comentar seus códigos e script
echo "Hello, world!"
Ao longo deste Notebook você verá diferentes comandos no shell. Eles serão explicados, mas aqui está um pequeno conjunto dos comandos mais comuns.
%%bash
# Crie uma pasta (folder)
# Em programação, pasta é chamada de diretório. Usaremos o nome diretório daqui em diante.
# O nome pasta pode ser qualquer coisa (por exemplo, pasta1, pasta_1, etc.), tente sempre nomear diretórios que você lembre quais dados você está salvando nele
mkdir folder
%%bash
# lista de arquivos e diretórios
# Em geral, os diretórios têm um / no final (por exemplo, /Documentos/Arquivos/scRNAseq_data/, aqui temos três diretórios
ls
%%bash
# Um comando pode ser seguido para argumentos. Argumentos especificam seu código principal. Podem ser - ou -- ou posicionais (ou seja, dependem da ordem).
# É uma coisa importante saber sobre um software que você deseja usar.
ls -l
%%bash
# O comando cd é usado para entrar ou sair de um diretório
# Se você quiser ir para outro diretório, você pode usar cd .. para voltar para frente ou somente cd para ir para frente
cd
%%bash
# O comando mv é usado para mover seu arquivo para um diretório específico
# Você só precisa especificar o caminho para o diretório para o qual deseja mover seu arquivo
mv seu_arquivo local_para_mover/
%%bash
# Além disso, mv pode alterar nomes de diretórios ou arquivos. Tente:
mv folder/ diretório/
%%bash
# Além disso, mv pode alterar nomes de diretórios ou arquivos. Tente:
mv folder/ diretório/
# O comando cat mostra todo o conteúdo do seu arquivo
%%bash
cat
# Além disso, você pode concatenar (juntar) dois ou mais arquivos usando este comando
# O arquivo unificado irá aparecer após '> "nome_do_arquivo"'
%%bash
cat arquivo_1 arquivo_2 > arquivo_3
# O comando head mostra as primeiras 10 linhas do seu arquivo
# Como a cabeça do "cat"
%%bash
head your_file
# O comando tail mostra as últimas 10 linhas do seu arquivo
# Como um tail do "gato"
%%bash
tail
# O comando wget é usado para baixar arquivos
# Você pode colocar um link ao lado do comando para baixar dados (por exemplo, um conjunto de dados específico de um banco de dados)
# Aqui está um exemplo de uma amostra de RNA-seq do SRA
%%bash
wget https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra?run=SRR24765940
Instalação
Para começar, você deve baixar o SRAtoolkit para usar a ferramenta fastq-dump, que permite baixar arquivos SRA.
O SRA Toolkit é um conjunto de ferramentas desenvolvido pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI) para acessar, baixar e manipular dados de alto rendimento armazenados no Sequence Read Archive (SRA)
O fastq-dump é uma das ferramentas do SRA Toolkit. Ele é usado para extrair dados no formato FASTQ ou FASTA de acessos SRA. O FASTQ é um formato comum para armazenar dados de sequenciamento de DNA e RNA, que inclui as leituras de sequência e suas qualidades. O fastq-dump permite que os usuários convertam arquivos SRA em arquivos FASTQ, facilitando o processamento e a análise desses dados em outras ferramentas de bioinformática.
%%bash
# O -q é para o modo de saída, para não fornecer toda o texto de saída do wget, apenas executar silenciosamente.
# O --output-document é para especificar o nome do arquivo onde o conteúdo baixado deve ser salvo.
wget -q --output-document sratoolkit.tar.gz https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/3.1.0/sratoolkit.3.1.0-ubuntu64.tar.gz
# .tar.gz é um arquivo que foi primeiro empacotado com tar e depois compactado com gzip.
# O comando tar é usado para compactar ou descompactar arquivos em sistemas Unix/Linux. O nome "tar" vem de "tape archive"
# -xzf: indica que o tar deve extrair o conteúdo de um arquivo compactado com gzip.
tar -xzf sratoolkit.tar.gz
Então, para testar o download, você pode ver as três primeiras leituras de um único número de acesso SRA.
%%bash
# sratoolkit.3.1.0-ubuntu64 é o diretório principal, bin é intermediário e fastq-dump é um software de interesse
# -X 3: Limita a extração às 3 primeiras leituras do arquivo SRA. A opção -X define o número máximo de leituras a serem extraídas.
# --stdout: Instrui o fastq-dump a enviar a saída para o stdout (saída padrão) em vez de gravar em arquivos locais.
sratoolkit.3.1.0-ubuntu64/bin/fastq-dump -X 3 SRR11537950 --stdout
Dowload do SRA
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# Baixaremos os arquivos SRR11537950
# sratoolkit.3.1.0-ubuntu64/bin/fastq-dump: Este é o PATH para o executável fastq-dump dentro da instalação do SRA Toolkit.
# --split-files: Esta opção instrui o fastq-dump a dividir os arquivos de leitura de pares em dois arquivos separados.
# --gzip: Esta opção compacta a saída no formato gzip, ou seja, reduz o tamanho do arquivo.
# -X 1000000: Limita o número de leituras extraídas.
sratoolkit.3.1.0-ubuntu64/bin/fastq-dump --split-files --gzip -X 1000000 SRR11537950
# Crie um diretório com o mesmo número de acesso SRA
mkdir -p SRR11537950
# Mova tudo com as informações "SRR11537950" e ".fastq.gz" para uma pasta
mv SRR11537950*.fastq.gz SRR11537950/
# Renomeie os arquivos para nomes apropriados para o Cell Ranger.
mv SRR11537950/SRR11537950_1.fastq.gz SRR11537950/SRR11537950_S1_L001_R1_001.fastq.gz
mv SRR11537950/SRR11537950_2.fastq.gz SRR11537950/SRR11537950_S1_L001_R2_001.fastq.gz
%%bash
# list of archives
ls
